實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增系統(tǒng)(qPCR)作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性技術(shù)，自1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出以來(lái)，已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)、遺傳變異研究等多個(gè)領(lǐng)域。該技術(shù)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA或RNA序列的精確量化，為科研人員提供了前-所未有的精準(zhǔn)度與效率。
技術(shù)原理
qPCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。熒光基團(tuán)可以是SYBR Green等非特異性染料，也可以是TaqMan探針等特異性標(biāo)記。隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，熒光信號(hào)會(huì)隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)，從而允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并定量初始模板的數(shù)量。
熒光擴(kuò)增曲線一般由基線期、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期組成。在基線期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化;在指數(shù)擴(kuò)增期，熒光信號(hào)超過(guò)背景信號(hào)并到達(dá)閾值，此時(shí)循環(huán)數(shù)稱為Ct值(Cycle Threshold)，Ct值與模板起始濃度的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系，因此可用于定量模板起始濃度;在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，無(wú)法用于定量分析。
主要類型與定量方法
qPCR所使用的熒光化學(xué)材料可分為兩大類：熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR Green I為主要代表，是非特異性熒光化學(xué)材料，能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合并發(fā)出熒光，信號(hào)強(qiáng)度與PCR擴(kuò)增的DNA量成正比。熒光探針包括TaqMan、分子信標(biāo)等，屬于特異性熒光材料。TaqMan探針技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)特異性探針，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被切割釋放熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高特異性和準(zhǔn)確性的定量分析。
定量方法包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)計(jì)算未知樣品的起始拷貝數(shù);相對(duì)定量則是通過(guò)比較不同樣本中同一目的基因的相對(duì)表達(dá)量來(lái)分析基因表達(dá)差異。
應(yīng)用領(lǐng)域
qPCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。在分子生物學(xué)研究中，qPCR技術(shù)可用于基因表達(dá)調(diào)控、基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究;在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，qPCR技術(shù)可用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、傳染病監(jiān)控及個(gè)性化醫(yī)療;在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，qPCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因作物的定性檢測(cè)、品系鑒定及轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測(cè)。
結(jié)論
實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增系統(tǒng)(qPCR)以其高靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，在核酸定量分析中發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，qPCR系統(tǒng)的功能和性能也在不斷提升，為科研人員提供了更加高效、精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)工具。未來(lái)，qPCR技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動(dòng)科學(xué)研究的深入發(fā)展。
